咖啡酸，一种我们最为常见的东西，对人体好处颇多

两株代谢咖啡酸人肠道来源菌株的筛选、鉴定及其代谢过程初探

咖啡酸（Caffeic acid，CA）又叫做3，4-二羟基肉桂酸，是一类天然的酚类化合物。

咖啡酸广泛存在于多种物质中，包括水果、豆类、葡萄酒、橄榄油和咖啡等。

而近年来开展的科学研究也证实，咖啡酸有抗氧化、清除自由基、抗癌细胞、抗病毒、热耐受性强、降血糖等各种生理作用，在人体保健发挥着特殊的作用，是一类纯天然的活性物质。

此外，作为一种金属的螯合体，咖啡酸也能够避免由紫外线造成的细胞损伤。

目前的研究多集中于咖啡酸的生物活性功能研究，然而对咖啡酸是如何在人体内代谢进而发挥作用机制尚不明晰。

人体肠道是发酵和消化的场所，其中的肠道菌群组成复杂，数量巨大，包括拟杆菌、肠杆菌科、芽孢杆菌等。

然而，人体肠道菌群并非绝对恒定的，与年龄、环境、性别、饮食等多种原因相关，其中饮食是改变肠道菌群最直接可行的方法之一。

肠道是药物代谢的主要器官之一，多种化学功能物质都在肠道菌群的共同作用下进行新陈代谢过程，其中肠道菌群和肠壁酶起着十分关键的功能，利用药效学活性成分和粪便悬浮液与肠道菌群在厌氧条件下孵育，是研究中药物质代谢的最有效方法之一。

经科学研究的证实，咖啡酸在胃和小肠中的吸收率仅为30%左右，其主要吸收和代谢部位是结肠。

但肠道微生物与咖啡酸是如何相互作用，参与咖啡酸代谢的肠道微生物以及代谢产物尚不清楚。

本研究旨在明确参与咖啡酸代谢的肠道微生物及它们之间相互作用，并借助形态学研究，生理生化试验以及16S rRNA基因对两株肠道单菌株进行鉴定。

将该菌直接运用于咖啡酸体外发酵中，并通过对咖啡酸发酵过程中指标研究，采用薄层层析法和高效液相分析法鉴定咖啡酸代谢产物，进一步阐明了咖啡酸的主要代谢方式以及代谢过程，为营养物质的靶向代谢的科学研究提供了必要的参考和依据。

人体肠道粪便，联系5名志愿者（3男2女），要求无消化系统疾病，3个月内未服用抗生素或益生菌；咖啡酸（AR 98%）、间香豆酸（≥98%）、3-(3-羟基苯基)丙酸（≥98%）：上海源叶生物科技有限公司。

细菌基因组DNA提取试剂盒：北京索莱宝科技有限公司，切胶回收试剂盒：OMEGA公司，Taq酶PCR试剂盒（武汉康为世纪生物科技有限公司）；甲醇（≥99.5%）、甲酸（88%）、冰乙酸、氯仿：国药集团化学试剂有限公司，琼脂糖：北京擎科生物科技有限公司，BHI液体培养基：青岛高科技工业园海生物技术有限公司；琼脂粉：北京索莱宝科技有限公司。

薄层色谱铝箔板：青岛邦凯高新技术材料有限公司。

BXM-30R压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；V－5100紫外分光亮度计：上海精科实业有限公司；LRH-250生化培养箱：广东省医疗器械厂；凝胶成像系统：Eppendorf公司；BioRad CFX96梯度PCR仪：Eppendorf公司；Spectra Max iD3多功能酶标仪：美谷分子仪器上海有限公司；S210 pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。

BHI液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛心浸粉17.5 g/L，氯化钠5.0 g/L，葡萄糖2.0 g/L，磷酸氢二钠（12H2O）2.5 g/L，调pH值在7.4±0.2之间，高温高压115°C灭菌15min。

使用的BHI固体培养基所需琼脂粉量：20 g/L。

称取1.00 g新鲜粪便，向超净台中加入10 mL无菌PBS，涡旋1~3 min，以1000 r/min离心5 min，将上清液移到无菌EP管中，加入无菌PBS 5000 r/min离心3 min，弃去上清液，洗涤两次并用无菌PBS重悬沉淀。

部分粪便悬浮液用于实验，其余部分加入无菌厌氧甘油（0.04% L-半胱氨酸）中，等分并储存于-80 ℃以备用。

准确称取50.0 mg咖啡酸粉末到2 mL无菌EP管中，加入1.0 mL80%甲醇并倒置混合，在超净工作台中用无菌0.22 μm滤膜过滤灭菌，以获得50 mg/mL无菌咖啡酸储存溶液。

保存在-40 ℃备用。

取一定量粪便悬液，以5000 r/min离心5 min，弃去上清，再用PBS洗涤两次后，离心重悬，并按1:50的体积比例，接种至BHI液体培养基中，然后置于厌氧罐中放在37 ℃摇床上，200 r/min，厌氧培养24 h。

将29.1 mL BHI液体培养基、300 μL咖啡酸母液（终浓度0.5 mg/mL）和600 μL人粪便细菌悬浮液加入到50 mL的锥形瓶中（未加人粪便细菌悬浮液作为阴性对照）。

之后将混合发酵液置于厌氧罐中，37 ℃下在200 r/min转速的振荡培养箱中避光发酵，在0 h、12 h、24 h、48 h和72 h时采样。

将每个样品以13000 r/min离心3-5 min，然后将发酵液转移到1.5 mL EP管中并储存在-20 ℃。

动态监测在发酵过程中细菌繁殖含量（OD600）和pH变化。

将体外发酵培养基解冻，利用薄层色谱法定性测定咖啡酸代谢情况[20]，展开剂为氯仿：甲醇：水：甲酸：冰醋酸（15:5:0.5:1:1，V/V），以浓度为0.5 mg/mL咖啡酸、间香豆酸和5mg/mL 3-（3-羟基苯基）丙酸为对照，在254 nm的紫外波长显色，比较比移值（Rf值）。

如果样品的Rf值等于咖啡酸，间香豆酸和3-（3-羟基苯基）丙酸的标准品，则表明样品含有咖啡酸，间香豆酸和3-（3-羟基苯基）丙酸。

根据1.2.5.2中的检测结果，将12 h的发酵液用BHI液体培养基稀释至10-4 - 10-6的梯度，于BHI固体培养基上进行涂布，置于恒温37 ℃的培养箱中厌氧培养12 h。

将培养基中不同颜色、形态和大小的菌株挑至BHI液体培养基中，并在37 ℃下厌氧孵育12 h。

将液体培养基中获得的菌株在BHI固体培养基中重复划线，以保证得到纯度较好的菌株，同时将得到的单菌落用50%厌氧甘油保存并储存在-80℃的冰箱中。

将分离纯化的单个细菌以1:50的比例加入含有咖啡酸的BHI液体培养基中，咖啡酸的终浓度为0.5 mg/mL，置于37℃振荡器中厌氧孵育24 h，用薄层层析法测定咖啡酸代谢情况。

将得到的可以代谢咖啡酸的菌株10、20号菌进行鉴定。

根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌系统分类学手册》对分离出的细菌进行细菌形态鉴定。

采用16S rRNA基因进行分子生物学鉴定，以菌株10和20的基因组作为PCR扩增模板，正向和反向引物分别为8F：5'-AGAGTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应（20 μL）如下：模板DNA 2 μL，KOD酶（1 unit/μL）0.4 μL，10 × KOD缓冲液2 μL，dNTP （2 mmol/L）2 μL，引物（F+R）1.2μL，MgSO4（25 mmol/L）1.2μL，双蒸水（ddH2O）11.2μL。

PCR扩增参数设置为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s持续35个循环，72 ℃再延伸2 min。

将所得PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增产物约为1600 bp，送往上海生工进行测序，16S rDNA序列在NCBI中进行BLAST同源序列检索，可以比较筛出菌株与已知菌株的系统发育关系和系统发育状态，如果同源性大于99%，则确认它们是同一类型的细菌，并使用Mega X软件创建系统发育树。

将10、20号菌划线活化后接至BHI液体培养基中，在37 ℃厌氧环境下孵育24 h，最后再按1:50（v/v）的比例加入到含有咖啡酸的BHI液体培养基中，咖啡酸的最终浓度为0.5 mg/mL。

将其置于厌氧罐中，37 ℃下进行厌氧发酵，并在发酵过程中动态监测细菌生长含量（OD600）和pH的变化。

最后通过薄层层析法和高效液相法鉴定咖啡酸的代谢产物。

将菌株以1：50的比例加入到含有咖啡酸的BHI液体培养基中，置于37 ℃摇床上厌氧培养，在0、6、12、24、48 h取样，用紫外分光亮度计测定OD600，并在相同条件下重复实验3次。

将菌株以1∶50的比例加入含咖啡酸的BHI液体培养基中，置于37 ℃摇床中厌氧培养，在0、6、12、24、48 h取样，以1：50比例接种菌株的BHI液体培养基为对照，用pH计测定pH，在相同条件下重复实验3次。